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          多能干細胞凍存和復蘇方法

          干細胞凍存是干細胞擴增傳代過程中重要的一環,但是干細胞不同于普通細胞系,其增殖擴增過程中需要聚團生長,為保持其細胞活性,不建議單細胞傳代。而且使用血清+DMSO凍存方法,不能很好的保持細胞活性,且復蘇細胞成活率較低。這次就重點介紹干細胞進行凍存以及解凍的標準化步驟。

          本方法適用于HAKATA? 人間充質干細胞無血清培養基以及HAKATA? 無血清細胞凍存液培養的細胞(同樣適用于mTesR以及E8系統培養的細胞),凍存以及復蘇前后,應當使用同一種培養基,復蘇傳代后可以更換其他培養體系。

          HAKATA? 無血清細胞凍存液是一款化學成分確定,無血清,無動物源成分,且無需程序降溫的高效凍存液。具體凍存及復蘇操作方法如下:

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          1、凍存:以下操作方法以6孔板為例:

          注意:如果使用mFreSR?,請將所需量的mFreSR?融化并置于冰上。

          (1) HAKATA? 無血清細胞凍存液為即拿即用,且4℃保存,凍存液拿出后應快速放回4℃;

          (2)使用干細胞消化液消化細胞;

          (3)收集細胞,室溫300×g離心5分鐘;

          (3)小心吸掉上清液,不要干擾細胞團;

          (4)用1ml凍存液重懸細胞,并均勻分裝到凍存管中

          采用非程序降溫法,將凍存管直接放入-80℃冰箱中,凍存24h后轉移至液氮中長期保存。

          2、解凍

          預先包被細胞培養板,人ES和iPS細胞解凍后應立即接種到培養板中。

          (1)干細胞培養基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱;

          (2)在水浴鍋中持續晃動凍存管,37℃水浴鍋中快速解凍細胞,直至細胞完全融化;

          (3)取出凍存管,用70%乙醇擦拭凍存管表面;

          (4)準備15ml離心管,預先加入5mL干細胞培養基,將細胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中,盡量保持細胞聚團狀態。

          (5)在室溫300×g離心5分鐘。

          (6)吸掉上清,注意不要干擾細胞沉淀。使用1mL多能干細胞培養基輕輕地重懸細胞3-5次,不要破壞細胞聚團狀態。

          (7)分別取0.5mL細胞懸液,均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中,并分別補充多能干細胞培養基至2m。

          (8)置于37°C細胞培養箱中。在前后左右呈十字形搖動培養板板5次,以均勻分散細胞。

          (9)每天更換培養基,并顯微鏡下觀察細胞狀。

          滬公網安備 31011402005095號

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